Куриный эмбрион Куриный эмбрион
(КЭ) - куриный зародыш, находящийся на разных стадиях эмбрионального развития. В микробиол. практике используют для выделения, культивирования и идентификации вирусов, риккетсий и иногда бактерий. Для лабораторных целей отбирают свежие, оплодотворенные, с хорошо просвечивающей и не имеющей трещин скорлупой КЭ. Инкубацию проводят в гнездах штатива тупым концом яйца вверх в хорошо вентилируемых инкубаторах или термостатах при 37 -37,5 °С, относительной влажности 63-65%. Для заражения отбирают 4- 13-дневные эмбрионы с выраженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обрабатывают спиртом, обжигают и в области введения (чаще над воздушной камерой) смазывают 2% йодной настойкой. Материал или иссл. к-ру вводят, вскрывая или не вскрывая скорлупу, в желточный мешок (риккетсий), в аллантоисную или амниотическую полости (большинство вирусов), наносят на хорион-аллантоисную оболочку. Реже к-ру вводят в тело эмбриона или в/в. Зараженные КЭ помещают в термостат в условиях и на сроки, к-рые зависят от вида микроба и целей исследования. Некоторые данные о результатах заражения можно получить при внешнем осмотре КЭ под микроскопом (инъекция сосудов, потеря подвижности и др.). Однако в большинстве случаев КЭ вскрывают. Для этого после обработки спиртом и йодной настойкой скорлупу срезают выше границы воздушного мешка, пастеровской пипеткой или шприцем отсасывают сначала аллантоисную, а затем амниотическую жидкость, избегая повреждения сосудов и желточного мешка. Эмбрион и хорионаллантоисную оболочку извлекают из скорлупы, помещают в стерильные чашки, промывают стерильной дистил. водой и осматривают. Дальнейший ход исследования эмбриона и его жидкостей зависит от вида микроба или вируса и целей опыта.
(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)
ЭМБРИОТОКСИЧНОСТЬ - эмбриотоксичность, способность физических, биологических, химических и других агентов оказывать отрицательное действие на развивающийся эмбрион. Эмбриотоксическое действие различных веществ устанавливают путем воздействия ими на самок… … Ветеринарный энциклопедический словарь
Запрос «Куры» перенаправляется сюда; см. также другие значения. ? Домашняя курица … Википедия
Куры Куры украшение любого двора Научная классификация Царство: Животные Тип: Хордовые Класс … Википедия
Цель занятия
Ознакомить студентов с методами отбора куриных эмбрионов для культивирования вирусов.
Оборудование и материалы
Куриные эмбрионы 9-12 дневного возраста инкубации, овоскоп, спиртовые тампоны, подставки для эмбрионов, пинцеты, ножницы, лейкопластырь, иглы, шприцы, простые карандаши, пробойники, иголочки, таблицы, схемы, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.
Методика проведения занятия и методические указания по теме
Объяснение преподавателя
Культивирование вирусов на куриных эмбрионах наиболее доступный и удобный метод для первичного выделения вируса. Практика применения этого метода заражения показала ряд преимуществ перед другими методами. Для заражения используют эмбрионы 5-12 дневной инкубации.
ДОСТОИНСТВА И НЕДОСТАТКИ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ КАК БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
Культивирование вирусов в куриных эмбрионах – наиболее доступный и удобный метод как для первичного выделения вирусов от больных животных и из объектов внешней среды, так и для последующего культивирования вирусов в лаборатории. Этот метод широко применяется для идентификации вирусов и антител, а также для приготовления вакцин и диагностикумов. Практика применения показала ряд преимуществ этого метода перед культивированием вирусов на лабораторных животных. Известно, что белые мыши, которых широко используют при вирусологических исследованиях, могут быть спонтанно заражены рядом вирусных инфекций: эктромелией, лимфоцитарным хориоменингитом, энцефалитом Тейлора, вирусной пневмонией, вирусом Сендай и другими, что крайне осложняет работу и нередко приводит к ошибочным выводам при оценке получаемых результатов. Культивирование вирусов на куриных эмбрионах в значительной мере устраняет указанные выше трудности. Наряду с этим от куриного эмбриона можно получить значительно большее количество вируса, чем от лабораторных животных. Куриный эмбрион обладает большей жизнеспособностью и устойчивостью к разного рода воздействиям, неизбежным при введении исследуемого материала. При известном навыке работы с эмбрионами и соблюдении правил асептики гибель их незначительна. Наибольший отход эмбрионов бывает при введении материала в амниотическую полость и желточный мешок, но и в этих случаях она не превышает 10–15 %, если соблюдены необходимые условия инкубирования.
Куриные эмбрионы как живая система вошли в вирусологическую практику в 30-х годах XX в. Их использование расширило спектр культивируемых в лабораторных условиях вирусов, позволило более успешно решать стоящие перед вирусологией задачи в связи с тем, что куриные эмбрионы имеют ряд преимуществ перед лабораторными животными: 1)скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от бактериального заражения со стороны внешней среды; 2) важным преимуществом эмбрионов является также их высокая чувствительность к широкому спектру вирусов, что объясняется недостаточным развитием защитных механизмов; 3) куриные эмбрионы легкодоступный объект в связи с развитием широкой сети птицефабрик и инкубаториев; 4) куриные эмбрионы экономичны, не требуют ухода и кормления.
Основными недостатками являются: 1) невозможность полностью гарантировать стерильность этой живой системы, так как эмбрионы могут нести в своем содержимом вирусы и другие патогенные агенты (вирусы инфекционного бронхита кур, ньюкаслской болезни, гриппа, лейкоза, хламидии и микоплазмы). Их присутствие может искажать результаты исследования; 2) куриные эмбрионы чувствительны не ко всем вирусам.
ЦЕЛИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ
Используют куриные эмбрионы в вирусологии в основном для тех же целей, что и лабораторных животных, а именно:
– обнаружения в патматериале активного вируса биопробой;
– первичного выделения вируса. Эффективно выделяют и культивируют на куриных эмбрионах вирусы, вызывающие заболевания у птиц, а также некоторые вирусы млекопитающих;
– поддержания вирусов в лаборатории;
– титрования вирусов;
– накопления вируса для лабораторных исследований и получения вакцин;
– как тест-объект в реакции нейтрализации.
ТРЕБОВАНИЯ К КУРИНЫМ ЭМБРИОНАМ
Яйца необходимо получать из благополучных по вирусным болезням хозяйств. В оплодотворенных яйцах даже от клинически здоровых кур могут находиться различные встречающиеся у этих птиц вирусы: ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита, энцефаломиелита, парагриппа-2, полиартрита, оспы, арбовирусы, аденовирусы и др. Присутствие этих вирусов может, с одной стороны, привести к диагностическим ошибкам, а с другой, на основе явления интерференции, – к подавлению размножения вируса, находящегося в исследуемой пробе. Эмбрионы, не содержащие вируса, но полученные от кур, бессимптомно зараженных определенными вирусами, также могут быть менее чувствительны или абсолютно нечувствительны к действию данного вируса благодаря наличию специфических антител, полученных от матери с желтком. Для удачного выделения вируса необходимо, чтобы куры, эмбрионы которых используют в работе, не были вакцинированы против болезни, возбудителя которой ищут. Скорлупа яиц должна быть непигментированной, чистой (мыть нельзя). Возраст эмбриона должен соответствовать избранному методу заражения.
Для обеспечения нормального развития зародышей в оплодотворенных яйцах в период инкубации необходимо соблюдать определенную температуру и влажность. Развивающиеся эмбрионы переносят перегрев значительно хуже, чем охлаждение. Поэтому кратковременная (в течение нескольких часов) поломка в системе обогрева не приносит большого вреда. При более длительном перерыве необходим подогрев.
Инкубируемые яйца нуждаются в свободном доступе свежего воздуха, который поступает через отдушины. Они должны быть всегда открытыми. Одно яйцо, как принято считать, расходует 1 л кислорода в день, что неудивительно, если вспомнить о бурном развитии зародыша в течение 21 дня инкубации. Именно поэтому яйца нельзя класть вплотную, а также одно на другое. Для инкубации яиц непригодны обычные термостаты. Лишь в случае крайней необходимости их можно использовать для этих целей, но при этом часто проветривать ипоставить внутрь сосуд с водой для обеспечения требуемой влажности.
Заложенные на инкубацию яйца через 3–5 дней просвечивают с помощью специальной настольной или ручной (если яйца не вынимают из лотка инкубатора) лампы, чтобы отобрать неоплодотворенные. Наиболее удобны для вирусологических работ яйца леггорнов, так как их тонкая белая скорлупа позволяет лучше рассмотреть содержимое. Неоплодотворенные или содержащие погибших зародышей яйца из инкубатора удаляют. Доля оплодотворенных яиц колеблется в значительных пределах в зависимости от многих факторов, в том числе от времени года: весной она самая высокая, зимой самая низкая.
Второй раз зародыши просвечивают в день запланированного заражения. Срок этот зависит от вида вируса, а также пути его введения. На скорлупе обычным (не чернильным) карандашом отмечают место заражения.
СТРОЕНИЕ КУРИНОГО ЭМБРИОНА
Обычно курица откладывает оплодотворенное яйцо, в котором зародыш находится на стадии бластулы или ранней гаструлы. При нагревании яйца до температуры, близкой к температуре тела курицы, происходит дальнейшее развитие зародыша (рис. 15). В период с 5-го по 12-й день инкубации куриные эмбрионы могут быть использованы для заражения вирусами.
Рисунок 15 - Схематический разрез куриного эмбриона на 8-й день инкубации: 1 – скорлупа; 2 – подскорлупная оболочка; 3 – хорионаллантоисная оболочка; 4 – аллантоисная полость; 5 – желточный мешок; 6 – белок; 7 – воздушная камера; 8 – тело зародыша; 9 – амниотическая полость
Яйцо с развивающимся куриным эмбрионом покрыто снаружи твердой пористой скорлупой, к которой плотно прилегает подскорлупная оболочка. Последняя в тупом конце яйца разделяется на два листка, между которыми образуется воздушная камера. Тело зародыша лежит в яйце эксцентрично, спиной ближе к скорлупе, голова направлена в сторону воздушной камеры. Зародыш погружен в околоплодную жидкость, заполняющую амниотическую полость, и пуповиной связан с желтком. Желток также располагается эксцентрично и относительно зародыша как бы по другую сторону продольной оси.
Непосредственно под подскорлупной оболочкой находится аллантоисная полость, покрывающая амнион и желточный мешок, а к 10-11-му дню замыкающаяся в остром конце яйца. В процессе развития аллантоисная оболочка срастается с хорионом, образуя единую хорионаллантоисную оболочку (ХАО). В остром конце яйца находится остаток белка.
Заражение в ту или другую часть эмбриона проводится в период ее максимального развития, когда количество чувствительных клеток будет наибольшим.
В процессе инкубации меняются размеры зародышевых структур, что во многом объясняется их функциональным назначением и определяет оптимальный для заражения возраст эмбриона.
Так, желточный мешок как резервуар питательных веществ имеет наибольший объем в начале инкубации, а затем (после 12-го дня) по мере развития зародыша он уменьшается. Заражают в желточный мешок с 5-го по 7-й день инкубации.
Амниотическая полость, являясь буферной средой развития зародыша, покрывает его уже на 5-й день инкубации. Среднее количество жидкости к середине периода инкубации составляет около 1 мл.
Для заражения в амниотическую полость используют эмбрионы в возрасте 6-10 дней.
Аллантоисная полость служит для сбора продуктов обмена, в ней скапливаются мочекислые соли, фосфорные и азотистые соединения. В процессе роста и развития зародыша аллантоисная жидкость приобретает кислую реакцию. Максимальных размеров аллантоисная полость достигает на 9-12-й день развития эмбриона, поэтому заражение в аллантоисную полость проводят преимущественно на 9-11-й день инкубации.
Хорионаллантоисная оболочка богата кровеносными сосудами, которые, тесно прилегая к внутренней поверхности пористой скорлупы, насыщаются кислородом и снабжают им тело зародыша, выполняя функцию органа дыхания эмбриона. Максимального развития ХАО достигает на 11-13-й день. Заражение на хорионаллантоисную оболочку проводят на 10-12-й день инкубации.
ПОДГОТОВКА КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ К ЗАРАЖЕНИЮ
Эмбрионы доставляют из инкубатория, не допуская их охлаждения в пути. В лаборатории эмбрионы инкубируют в термостате при температуре 37 °С и влажности 60-70 %, что достигается установлением в термостате открытых широкогорлых сосудов с водой. Вентиляционные отверстия термостата должны быть открыты. Эмбрионы размещают воздушной камерой вверх в специальных штативах. Рекомендуется до момента заражения дать возможность эмбрионам в течение суток адаптироваться к новым условиям и нормализовать свои функции после транспортного стресса. Если лаборатория располагает собственным инкубаторием, то снесенные курицей оплодотворенные яйца пригодны для закладки в него в течение 10 дней.
Подготовка куриных эмбрионов к заражению включает овоскопирование и дезинфекцию скорлупы, а также соответствующую подготовку рабочего места. Овоскопирование представляет собой просмотр яиц против достаточно яркого источника света (овоскоп), в результате чего на неосвещенной стороне скорлупы образуются тени от внутренних структур (рис. 16). Овоскопирование проводят в затемненном помещении. При этом на скорлупе графитным карандашом отмечают границу воздушной камеры, место расположения зародыша и участок бессосудистой зоны размером 0,5x0,5 см. Эти отметки служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала. При овоскопировании также определяют, жив зародыш или погиб. Зародышей, проявляющих активные движения при хорошей кровенаполненности сосудов ХАО, считают живыми.
Рисунок 16 - Овоскопирование куриного эмбриона на 10-е сутки инкубации. Видны тени: 1 – зародыша; 2 – желточного мешка; 3 – кровеносных сосудов ХАО; 4 – воздушной камеры; 5 – белка
Куриные эмбрионы заражают в асептических условиях (лучше в боксе). В предбокснике скорлупу эмбрионов обрабатывают йодированным спиртом, затем уже в боксе повторно протирают, а иногда еще и фламбируют – обрабатывают пламенем смоченного спиртом тампона.
Эмбрионы фиксируют в специальных подставках, установленных в эмалированной кювете на 3–4-слойной марлевой салфетке, смоченной дезинфицирующим раствором.
В работе используют инструменты, стерилизованные кипячением. Их ставят в баночку со спиртом и обжигают пламенем горелки перед каждым повторным использованием.
Демонстрация
а) клинических признаков заболевания у зараженных лабораторных животных; б) методов умерщвления лабораторных животных; в) техники вскрытия (обращают внимание студентов на состояние внутренних органов) и приемов получения вируссодержащего материала; г) техники изготовления отпечатков мозга; д) действий по обеззараживанию рабочего места и трупа после вскрытия зараженного животного.
Задания
1.Изучить строение куриного эмбриона.
2.Провести овоскопию куриного эмбриона, определить его жизнеспособность и отметить границы теней естественных образований.
3. Подготовить куриные эмбрионы к заражению.
Самостоятельная работа студентов
а) распознавание по цветной метке зараженных каждым из студентов мышей, анализ их клинического состояния, умерщвление, фиксация в кювете с восковым (парафиновым) дном, вскрытие; б) анализ патологоанатомических изменений, получение вируссодержащего материала (паренхиматозных органов), приготовление послойных отпечатков мозга.
Студенты проводят овоскопию куриного эмбриона, определяют его жизнеспособность и отмечают границы теней естественных образований.
Подведение итогов занятия
Задание к следующему занятию
Контрольные вопросы
1. Строение куриного эмбриона.
2. Для чего используют куриные эмбрионы в вирусологии?
3. Каково строение развивающегося куриного эмбриона?
Цель занятия: ознакомить студентов с методами заражения куриных эмбрионов для культивирования вирусов.
Оборудование и материалы: куриные эмбрионы 9-12 дневного возраста инкубации, овоскоп, спиртовые тампоны, подставки для эмбрионов, пинцеты, ножницы, лейкопластырь, иглы, шприцы, простые карандаши, пробойники, иголочки, таблицы, схемы, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.
Существенно влияет на размножение вирусов в эмбрионах метод заражения. Перед заражением инкубированные яйца про-свечивают, погибшие отделяют. На скорлупе яиц с живыми эмбрионами, кото-рые различают по красному цвету кровеносных сосудов и движению эмбриона, карандашом отмечают место заражения.
Заражают эмбрионы в стерильном боксе, имеющем рабочий стол, два табуре-та, подводку газа, водопровод и вакуум. Заражение в амниотическую полость проводят в затемненной комнате. Рабочее место должно быть хорошо освещено. Перед работой стол дезинфицируют. Для дезинфекции поверхности яиц под-готавливают антисептический раствор (70%-ный спирт, 2%-ный раствор йода) и обернутую ватой деревянную палочку, согнутый зубной зонд или бормашину для просверливания яичной скорлупы. Яйца заражают при помощи стерильных шприца для туберкулинизации и специальных игл. Место заражения на яйце заливают парафином. Для этого готовят парафиновые палочки: в пробирку, за-полненную расплавленным парафином, вводят стеклянную палочку, следя за тем, чтобы она находилась в центре пробирки до остывания парафина.
Когда парафиновая палочка понадобится, стенки пробирки нагревают на го-релке и за стеклянную палочку вытягивают парафин из пробирки. Подержав палочку над пламенем, расплавляют необходимое для закрытия отверстия в яйце количество парафина. Этот способ очень чист, и при нем не образуются пары парафина.
Кроме того, на рабочем столе в боксе размещают стакан со стерильными ватными тампонами, стакан с 3 % раствором едкого натра для использо-ванных инструментов и сосуд с раствором хлорамина для использованных стек-лянных предметов. В случае надобности можно приготовить подставку для яиц, небольшую эмалированную чашку и стерильные питательные среды. Подготов-ленный таким образом рабочий стол в течение 1-2 ч подвергают УФ-облучению .
Учитывая патогенность исследуемых вирусов, работы ведут в маске, резино-вых перчатках и защитных очках.
Существует шесть методов заражения эмбрионов. Наиболее часто используют заражение в аллантоисную полость и на хорионаллантоисную оболочку, реже - в амниотическую полость и в желточный мешочек и совсем редко - в тело зародыша и в кровеносные сосуды ХАО. Выбор метода определяется тропизмом вируса, а также целью заражения. При любом методе заражения вводят 0,1-0,2 мл инфекционного материала.
При заражении этим методом хорошо размножаются вирусы гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей, везикулярного стоматита и др. Существует несколько вариантов метода.
Первый вариант. Эмбрион фиксируют вертикально тупым концом вверх. В скорлупе на стороне зародыша, а иногда с противоположной зародышу стороны на 5-6 мм выше границы воздушной камеры делают отверстие диаметром около 1 мм. Иглу вводят параллельно продольной оси на глубину 10-12 мм (рис. 16). После инъекции вируссодержащего материала иглу извлекают, а отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного стерильного парафина.
Рисунок 16. Заражение в аллантоисную полость (первый вариант) (по Николау)
Второй вариант. Сделанное в скорлупе над воздушной камерой отверстие используют лишь для выхода части воздуха. Отверстие же для самого заражения делают на участке бессосудистой зоны хорионаллантоисной оболочки (ХАО) со стороны зародыша. Иглу вводят на глубину не более 2-3 мм. Инъецируют инфицирующую жидкость в объеме 0,1-0,2 мл и закрывают отверстие парафином (см. рис. 17).
Этот метод заражения куриных эмбрионов чаще используют для культивирования эпителиотропных и пантропных вирусов оспы, инфекционного ларинготрахеита птиц, чумы плотоядных , болезни Ауески , катаральной лихорадки овец и др.
Такое заражение может быть выполнено через естественную или искусственную воздушную камеру.
Для заражения через естественную воздушную камеру эмбрион помещают в штатив вертикально тупым концом вверх и в скорлупе против центра воздушной камеры вырезают круглое окно диаметром 15-20 мм. Через это окно пинцетом снимают подскорлупную оболочку. На обнажившийся участок ХАО наносят 0,2 мм вируссодержащей суспензии (рис. 18), отверстие закрывают лейкопластырем или реже покровным стеклом, укрепив его расплавленным парафином.
Заражение через искусственную воздушную камеру применяют чаще первого, так как оно обеспечивает контакт вируссодержащего материала с большей поверхностью ХАО и, следовательно, ведет к образованию большего количества вируса.
Рисунок 17. Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость (второй вариант) (по Николау)
Рисунок 18. Заражение на ХАО через естественную воздушную камеру (по Николау и др.)
Рисунок 19. Заражение куриного эмбриона на ХАО через искусственную воздушную камеру (по Николау и др.)
Для заражения эмбриона этим методом его помещают в штатив горизонтально зародышем вверх. В скорлупе делают два отверстия: одно небольшое над центром воздушной камеры (предназначено для отсасывания из нее воздуха), а другое диаметром 0,2-0,5 см сбоку, со стороны зародыша. Сложность метода в том, что, делая второе отверстие, необходимо осторожно снять вначале кусочек скорлупы, затем скользящим движением, не повреждая ХАО, сдвинуть подскорлупную оболочку в сторону так, чтобы через образовавшийся дефект мог пройти воздух. После этого резиновой грушей через первое отверстие отсасывают воздух из естественной воздушной камеры (рис. 19, а).В результате через боковое отверстие наружный воздух устремляется внутрь, образуя искусственную воздушную камеру, дном которой является ХАО (рис. 19, б).
Через боковое отверстие на поверхность ХАО наносят инфекционную жидкость и отверстие закрывают кусочком лейкопластыря. Закрывать первое отверстие нет необходимости, так как внутренний листок подскорлупной оболочки при этом методе заражения не нарушается и продолжает выполнять роль барьера для микрофлоры окружающей среды.
Дальнейшую инкубацию эмбрионов, зараженных этим методом, проводят в горизонтальном положении боковым отверстием вверх.
Большей частью им пользуются для размножения хламидий, а также вирусов болезни Марека , ринопневмонии лошадей, катаральной лихорадки овец и др. Заражают эмбрионы 5-7-дневного, а иногда и 2-3-дневного возраста (вирус лихорадки долины РИФ). Используют два варианта заражения.
Первый вариант. Эмбрионы помещают в штатив в вертикальном положении. Делают отверстие в скорлупе над центром воздушной камеры и вводят иглу на глубину 3,5-4 см под углом 45° к вертикальной оси в направлении, противоположном месту нахождения зародыша (рис. 20).
Рисунок 20. Заражение куриного эмбриона в желточный мешок (по Николау и др.)
Второй вариант. Иногда аналогичный путь заражения осуществляется на горизонтально укрепленном в штативе эмбрионе; при этом зародыш находится внизу, а желток над ним. Отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного парафина.
Для этой цели используют эмбрионы 6 - 10-дневного возраста. Метод используется при культивировании вирусов гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей и др. Есть два способа заражения.
Закрытый способ. Заражение проводят в затемненном боксе. Яйцо помещают на овоскопе в горизонтальном положении зародышем вверх. Через отверстие в скорлупе над воздушной камерой вводят иглу с затупленным концом по направлению к зародышу. Доказательством того, что игла проникла в амнион, служит движение тела зародыша в направлении передвижения.
Открытый способ. Скорлупу над воздушной камерой срезают так, чтобы образовалось окно диаметром 1,5-2,5 см. Через него пинцетом под контролем глаза снимают подскорлупную оболочку. Затем анатомический (14 см) пинцет с сомкнутыми браншами ведут, продавливая хорионаллантоисную оболочку по направлению к зародышу. Когда пинцет достигнет его, бранши размыкают, захватывают амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к окну. Удерживая левой рукой пинцет с фиксированной в нем оболочкой амниона, вводят вируссодержащий материал (рис. 21). Далее все оболочки опускают, окно закрывают лейкопластырем и эмбрион инкубируют в вертикальном положении.
Рисунок 21. Заражение куриного эмбриона в амнион открытым способом (по Николау и др.)
При овоскопировании 11- 13-дневных эмбрионов отмечают крупный кровеносный сосуд. По его ходу удаляют участок скорлупы, наносят 1-2 капли спирта, что делает на некоторое время подскорлупную оболочку прозрачной. Под контролем глаза на овоскопе иглу вводят в сосуд, что подтверждается его подвижностью при небольших боковых движениях иглы. Обнаженный участок подскорлупной оболочки закрывают кусочком лейкопластыря.
Можно материал в сосуды ввести и несколько отличающимся способом: срезают скорлупу над воздушной камерой, подскорлупную оболочку смачивают спиртом и в ставшие видными сосуды ХАО вводят материал. Отверстие закрывают кусочком стерильного лейкопластыря.
Описанные технические приемы экспериментального заражения куриных эмбрионов не единственные, а имеют различные варианты.
Для заражения используют эмбрионы 7-12-дневного возраста. Известно два варианта метода.
Первый вариант. Заражают так же, как в амнион закрытым способом, с той лишь разницей, что берут острую иглу и на овоскопе показателем попадания иглы в тело считают подчинение зародыша движениям иглы.
Второй вариант. Заражают так же, как в амнион открытым способом: через окно в скорлупе подтягивают пинцетом тело зародыша. Материал вводят в головной мозг или определенные участки тела. При таких методах заражения бывает значительный процент неспецифической гибели эмбрионов.
Перед дальнейшей инкубацией на скорлупе зараженных любым методом куриных эмбрионов простым (графитным) карандашом пишут, чем заражен эмбрион и когда, а если нужно, то и другие сведения. Зараженные куриные эмбрионы помещают в термостат для дальнейшей инкубации, в процессе которой происходят репродукция внесенных вирусов и их накопление в соответствующих структурах. Температура инкубации эмбрионов варьирует от 33 до 38 °С в зависимости от свойств вируса, которым проведено заражение. За эмбрионами ведут постоянное наблюдение, просматривают на овоскопе, отбирая павшие.
Гибель эмбрионов в первые 24 ч после заражения чаще всего обусловлена размножением грибов, бактериальной микрофлоры, внесенных в эмбрион вместе с инокулятом, или травмированием при заражении. Эта гибель считается неспецифической. В более поздние сроки эмбрионы гибнут в результате, как правило, размножения в эмбрионах вируса. Обнаружив погибшие эмбрионы, их сразу же переносят в холодильник с температурой 4 °С. Такие условия, с одной стороны, способствуют сохранению активности накопившегося в эмбрионе вируса, с другой - уплотнению тканей и запустению сосудов, что значительно облегчает последующее вскрытие.
Эмбрионы инкубируют до момента максимального накопления вируса. Для каждого вируса и даже штамма этот срок является определенным и варьирует в пределах от 2 до 7-8 сут. Так, для вируса ньюкаслской болезни штамма Н он составляет 2-3 дня, для того же вируса штамма В,- 5 дней, для вируса инфекционного ларинготрахеита птиц - 5 дней и т. д. Затем все эмбрионы умерщвляют охлаждением при 4 °С в течение не менее 3-4 ч и вскрывают.
Воснове метода лежит удаление эмбриона из яйца в период, когда к его скорлупе изнутри полностью прилегает хорионаллантоисная оболочка. Если внутрь такого яйца добавить питательную среду, то образует-ся своеобразная культура ткани, в которой может размножаться вирус. Метод обладает рядом преимуществ: он позволяет получить более чистый вирус, чем в аллантоисно-амниотической жидкости, что важно для снижения аллергизирующих свойств вакцин, приготовленных из этого материала; отсутствие желточного мешка и, следовательно, содержащихся в нем специфических антител позволяет лучше размножаться некоторым вирусам. В некоторых случаях этот метод дает хорошие результаты в диагностических работах, так как при нем можно вводить большие количества исследуемого материала, что увеличивает возможность вы-деления вируса.
Метод предложил Бернкопф еще в 1949 г., но из-за трудностей применения широко не используется. Трудности эти связаны со свойством хорионаллантоисной оболочки в процессе инкубации отделяться от скорлупы, что снижает ценность культуры и затрудняет манипуляции получения вируса и замены пита-тельной среды.
Е. Гройель (1963) ввел ряд модификаций, которые позволили устранить эти трудности. Он предложил использовать 15-дневные и даже более старые яйца, которые в процессе инкубации следует часто переворачивать для равномерного развития оболочки на скорлупе яйца. При просвечивании обозначают границы воздушной камеры. Скорлупу отпиливают на 0,5 см выше этой линии, на край скорлупной оболочки наливают расплавленный парафин (56-58 С°), который застывая, фиксирует край яйца. Затем вырезают круглое отверстие в оболочке над зародышем, оставляя вокруг узкий ободок. Следующий этап - осторожное удаление зародыша из яйца. При этом яйцо следует удерживать в горизонталь-ном положении и медленно поворачивать. Таким путем находят сосуды, связы-вающие эмбрион с ХАО, и перерезают их ножницами. Если яйцо держать верти-кально, то зародыш своей массой оттягивает оболочку, отрывая ее обычно в области острого конца яйца. Попадание даже небольшого количества жидкости между ХАО и скорлупой вызывает полную отслойку оболочки в течение 1-2 дней.
После удаления зародыша оболочку, выстилающую яйцо, несколько раз про-мывают физиологическим раствором, охлажденным до 4-0°С, до тех пор, пока жидкость не станет прозрачной. Затем в полость яйца вводят 20 мл питательной среды, подогретой до 37 °С, и яйцо закрывают стерильным резиновым колпач-ком, предварительно погрузив его в парафин. Трубка с резиновой пробкой, вмонтированная в яйцо, обеспечивает как взятие, так и введение жидкости без опасности бактериального заражения. Такой биологический объект сохраняет жизнеспособность в течение нескольких дней.
По методике Йошино и других, полость деэмбринированных яиц заполняют раствором агара в растворе Хенкса. Заражают деэмбринированные яйца через трубку в колпачке.
Контрольные вопросы:
1. Строение куриного эмбриона.
2. Для чего используют куриные эмбрионы в вирусологии?
3. Каково строение развивающегося куриного эмбриона?
Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста (чаще всего 9-12 дневные , иногда 5-12 дневные).
Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При овоскопировании живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом отмечают границы воздушного мешка. Заражают куриные эмбрионы в асептических условиях, стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом или спиртом.
Методы заражения куриных эмбрионов могут быть различны: нанесение вируса на хориоаллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную полости, в желточный мешок, тело зародыша. Выбор метода заражения зависит от биологических свойств изучаемого вируса.
Существует два способа заражения куриных эмбрионов:
1) открытый – скорлупу над воздушным мешком обрабатывают спиртом и йодом, при помощи острых ножниц срезают скорлупу, снимают верхний листок оболочки воздушного мешка и проводят заражение. Отверстие закрывают специальной стеклянной крышкой или скорлупой и герметизируют стерильным растопленным парафином.
2)Закрытый - скорлупу над воздушным мешком обрабатывают спиртом и йодом, делают колющим инструментом отверстие в скорлупе и вводят при помощи шприца с толстой иглой 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала под контролем овоскопа. Отверстие закрывают стерильным расплавленным парафином.
Зараженные эмбрионы инкубируют в термостате 2-4 суток. Затем их охлаждают до 4ºС на протяжении суток для максимального сужения сосудов. Вскрывают в стерильных условиях, предварительно обработав скорлупу спиртом или йодом.
Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по фокусным поражениям («бляшкам») на хорион-аллантоисной оболочке.
Культивировать вирусы возможно только в живых клетках. Для этого используют любую биологическую систему: животные организмы, куриные эмбрионы, культуры клеток. При выборе лабораторных животных необходимо выполнять следующие требования: - животные должны быть здоровы. Вновь поступивших в виварий содержат в карантине (мышей и крыс 14 дней, остальных - 21 день). Для исключения латентных (скрытых) инфекций вирусной этиологии.
Для всех животных выполняются требования: - животные должны быть чувствительными к данному вирусу; - возраст животного имеет большое значение: наиболее чувствительны молодые и новорожденные, но в некоторых случаях для выявления ярких клинических признаков болезни используют взрослых животных; - животные должны быть одного возраста и массы тела; лучше для этого подходят линейные животные, т.е. полученные в результате близкородственного скрещивания.
При вирусологических исследованиях применяют подкожное, накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, пероральное, интраназальное, интрацеребральное заражение лабораторных животных.
Куриные эмбрионы -- очень дешевая и удобная система культивирования вирусов гриппа. В эмбрионах в той или иной степени размножаются почти все штаммы вирусов как человеческого, так и животного происхождения. Наилучшим образом адаптированные к этой системе лабораторные штаммы дают в эмбрионах достаточно высокие титры, или 10--10 БОЕ на 1 эмбрион). Кроме того, эмбрион изолирован от внешней среды, и поэтому для размножения в нем вируса не нужно создавать специальные стерильные условия.
Вирус обычно вводят в заполненную жидкостью аллантоисную полость яйца, откуда он может проникнуть в хорионаллантоисную оболочку и заразить образующие ее клетки. Вирусное потомство выходит в аллантоисную жидкость и может быть легко извлечено из яйца путем отсасывания этой жидкости. Некоторые штаммы, в частности новые природные изоляты, а также вирусы типа С плохо размножаются на хорио-каллантоисной оболочке, но размножаются при введении непосредственно в амниотическую полость; при этом вирус получает доступ к разнообразным тканям эмбриона, и образующееся потомство выходит в амниотическую жидкость, которую можно извлечь отдельно.
Вирус лучше всего размножается в 10--12-дневных эмбрионах. Следует закупать свежие оплодотворенные яйца и инкубировать их нужное время в лаборатории. Для этого не обязательно иметь специальное оборудование, однако инкубатор очень удобен. Тем не менее яйца можно успешно инкубировать и в обычном термостате во влажной атмосфере при 37 °С, если их регулярно переворачивать. Сортность яиц не имеет особого значения, но в отдельных случаях важно исключить возможность заражения яйца другими микроорганизмами; некоторые поставщики продают специальные незараженные яйца.
Перед заражением следует убедиться в том, что яйца действительно оплодотворены. Для этого достаточно рассмотреть яйцо вблизи яркого источника света в темной комнате. Через 4--5 дней после оплодотворения эмбрион должен быть ясно виден.
При стандартном пассировании лабораторных штаммов вирусный инокулят обычно представляет собой образец инфицированной аллантоисной или культуральной жидкости. Как правило, образцы перед использованием разводят солевым раствором Хэнкса до концентрации вируса 10--10 БОЕ/мл, поскольку введение в яйцо большого количества вируса способствует образованию ДИЧ. Если перед заражением разведенный вирус приходится хранить, то в раствор для разведения следует ввести желатин. Естественно, необходимо обеспечить стерильность вируса, используемого для заражения; в тех случаях, когда это затруднительно, к инокуляту добавляют антибиотик гентамицин.
Данные методы предполагают использование гомогенизации для измельчения образцов, низкоскоростного центрифугирования для их осветления и введение неразведенного супернатанта в амниотическую полость.
Заражение эмбрионов.
I. Введение вируса в аллантоисную полость
II. Введение вируса в амниотическую полость
Время инкубации.
Оптимальное время инкубации, необходимое для получения максимального выхода вируса, зависит от конкретного штамма и должно быть определено экспериментально. Для некоторых штаммов вируса гриппа А, например вируса чумы птиц, максимальный выход достигается через 24--26 ч, в то же время большинство штаммов вируса гриппа А человека, а также вирусы типов В и С требуют 48--72 ч инкубации.
Сбор вируса.
Прежде чем пытаться извлечь из яйца вируссодержащую жидкость, рекомендуется охладить яйцо в течение 4--18 ч при 4°С или в течение 30 мин при --20 °С. При охлаждении эмбрион погибает, а окружающие его кровеносные сосуды сужаются. Таким образом, значительно уменьшается возможность контаминации вируссодержащей жидкости эритроцитами, которые могут связать часть вируса и тем самым уменьшить его выход. Если контаминации эритроцитами избежать все же не удается, потери вируса можно свести к минимуму, инкубируя материал 30 мин при 37 °С. В этих условиях вирионная нейраминидаза разрушает рецепторы эритроцитов, с которыми связывается вирус, и он освобождается.
I. Сбор аллантоисной жидкости
II. Сбор амниотической жидкости
Ожидаемый выход.
Интенсивность размножения вируса в эмбрионах зависит от конкретного штамма. Дикие штаммы первоначально дают очень низкие титры, но после нескольких пассажей на эмбрионах титр значительно возрастает. Для разных лабораторных штаммов, адаптированных к размножению на эмбрионах, выход также существенно варьирует, но в большинстве случаев в аллантоисной жидкости накапливается 2000--5000, а иногда и до 20 000 ГАЕ/мл вируса. Очевидно, что адаптация к размножению в эмбрионах связана с селекцией генетических вариантов, поэтому следует иметь в виду, что результаты детального генетического и биохимического исследования штаммов, пассированных на эмбрионах, не обязательно характеризуют исходный изолят.
